De novo assembly and functional annotation of Myrciaria dubia fruit transcriptome reveals multiple metabolic pathways for L-ascorbic acid biosynthesis

Abstract

Background: Myrciaria dubia is an Amazonian fruit shrub that produces numerous bioactive phytochemicals, but is best known by its high L-ascorbic acid (AsA) content in fruits. Pronounced variation in AsA content has been observed both within and among individuals, but the genetic factors responsible for this variation are largely unknown. The goals of this research, therefore, were to assemble, characterize, and annotate the fruit transcriptome of M. dubia in order to reconstruct metabolic pathways and determine if multiple pathways contribute to AsA biosynthesis. Results: In total 24,551,882 high-quality sequence reads were de novo assembled into 70,048 unigenes (mean length = 1150 bp, N50 = 1775 bp). Assembled sequences were annotated using BLASTX against public databases such as TAIR, GR-protein, FB, MGI, RGD, ZFIN, SGN, WB, TIGR_CMR, and JCVI-CMR with 75.2 % of unigenes having annotations. Of the three core GO annotation categories, biological processes comprised 53.6 % of the total assigned annotations, whereas cellular components and molecular functions comprised 23.3 and 23.1 %, respectively. Based on the KEGG pathway assignment of the functionally annotated transcripts, five metabolic pathways for AsA biosynthesis were identified: animal-like pathway, myo-inositol pathway, L-gulose pathway, D-mannose/L-galactose pathway, and uronic acid pathway. All transcripts coding enzymes involved in the ascorbate-glutathione cycle were also identified. Finally, we used the assembly to identified 6314 genic microsatellites and 23,481 high quality SNPs. Conclusions: This study describes the first next-generation sequencing effort and transcriptome annotation of a non-model Amazonian plant that is relevant for AsA production and other bioactive phytochemicals. Genes encoding key enzymes were successfully identified and metabolic pathways involved in biosynthesis of AsA, anthocyanins, and other metabolic pathways have been reconstructed. The identification of these genes and pathways is in agreement with the empirically observed capability of M. dubia to synthesize and accumulate AsA and other important molecules, and adds to our current knowledge of the molecular biology and biochemistry of their production in plants. By providing insights into the mechanisms underpinning these metabolic processes, these results can be used to direct efforts to genetically manipulate this organism in order to enhance the production of these bioactive phytochemicals. The accumulation of AsA precursor and discovery of genes associated with their biosynthesis and metabolism in M. dubia is intriguing and worthy of further investigation. The sequences and pathways produced here present the genetic framework required for further studies. Quantitative transcriptomics in concert with studies of the genome, proteome, and metabolome under conditions that stimulate production and accumulation of AsA and their precursors are needed to provide a more comprehensive view of how these pathways for AsA metabolism are regulated and linked in this species.

Antecedentes: Myrciaria dubia es un arbusto frutal amazónico que produce numerosos fitoquímicos bioactivos, pero es más conocido por su alto contenido de ácido L-ascórbico (AsA) en los frutos. Se ha observado una variación pronunciada en el contenido de AsA tanto dentro de los individuos como entre ellos, pero se desconocen en gran medida los factores genéticos responsables de esta variación. Los objetivos de esta investigación, por lo tanto, fueron ensamblar, caracterizar y anotar el transcriptoma del fruto de M. dubia con el fin de reconstruir las rutas metabólicas y determinar si múltiples vías contribuyen a la biosíntesis de AsA. Resultados: En total se ensamblaron de novo 24.551.882 lecturas de secuencias de alta calidad en 70.048 unigenes (longitud media = 1150 pb, N50 = 1775 pb). Las secuencias ensambladas se anotaron mediante BLASTX con bases de datos públicas como TAIR, GR-protein, FB, MGI, RGD, ZFIN, SGN, WB, TIGR_CMR y JCVI-CMR, y el 75,2% de los unigenes tenían anotaciones. De las tres categorías principales de anotaciones GO, los procesos biológicos representaron el 53,6% del total de anotaciones asignadas, mientras que los componentes celulares y las funciones moleculares representaron el 23,3% y el 23,1%, respectivamente. Basándose en la asignación de vías KEGG de los transcritos anotados funcionalmente, se identificaron cinco vías metabólicas para la biosíntesis de AsA: la vía animal, la vía del mio-inositol, la vía de la L-gulosa, la vía de la D-manosa/L-galactosa y la vía del ácido urónico. También se identificaron todos los transcritos que codifican enzimas implicadas en el ciclo ascorbato-glutatión. Por último, utilizamos el ensamblaje para identificar 6314 microsatélites genéticos y 23.481 SNP de alta calidad. Conclusiones: Este estudio describe el primer esfuerzo de secuenciación de próxima generación y anotación del transcriptoma de una planta amazónica no modelo que es relevante para la producción de AsA y otros fitoquímicos bioactivos. Se han identificado con éxito genes que codifican enzimas clave y se han reconstruido las vías metabólicas implicadas en la biosíntesis de AsA, antocianinas y otras vías metabólicas. La identificación de estos genes y vías concuerda con la capacidad observada empíricamente de M. dubia para sintetizar y acumular AsA y otras moléculas importantes, y se suma a nuestro conocimiento actual de la biología molecular y la bioquímica de su producción en plantas. Al proporcionar información sobre los mecanismos que subyacen a estos procesos metabólicos, estos resultados pueden utilizarse para dirigir los esfuerzos para manipular genéticamente este organismo con el fin de mejorar la producción de estos fitoquímicos bioactivos. La acumulación de precursores de AsA y el descubrimiento de genes asociados a su biosíntesis y metabolismo en M. dubia son intrigantes y merecen una mayor investigación. Las secuencias y vías aquí producidas presentan el marco genético necesario para futuros estudios. La transcriptómica cuantitativa, junto con los estudios del genoma, el proteoma y el metaboloma en condiciones que estimulen la producción y acumulación de AsA y sus precursores, son necesarios para proporcionar una visión más completa de cómo se regulan y relacionan estas vías del metabolismo de AsA en esta especie.