Simplifying plant gene silencing and genome editing logistics by a one-Agrobacterium system for simultaneous delivery of multipartite virus vectors

Abstract

Viral vectors provide a quick and effective way to express exogenous sequences in eukaryotic cells and to engineer eukaryotic genomes through the delivery of CRISPR/Cas components. Here, we present JoinTRV, an improved vector system based on tobacco rattle virus (TRV) that simplifies gene silencing and genome editing logistics. Our system consists of two mini T-DNA vectors from which TRV RNA1 (pLX-TRV1) and an engineered version of TRV RNA2 (pLX-TRV2) are expressed. The two vectors have compatible origins that allow their cotransformation and maintenance into a single Agrobacterium cell, as well as their simultaneous delivery to plants by a one-Agrobacterium/two-vector approach. The JoinTRV vectors are substantially smaller than those of any known TRV vector system, and pLX-TRV2 can be easily customized to express desired sequences by one-step digestion-ligation and homology-based cloning. The system was successfully used in Nicotiana benthamiana for launching TRV infection, for recombinant protein production, as well as for robust virus-induced gene silencing (VIGS) of endogenous transcripts using bacterial suspensions at low optical densities. JoinTRV-mediated delivery of single-guide RNAs in a Cas9 transgenic host allowed somatic cell editing efficiencies of ≈90%; editing events were heritable and >50% of the progeny seedlings showed mutations at the targeted loci.

Los vectores virales proporcionan una forma rápida y eficaz de expresar secuencias exógenas en células eucariotas y de modificar genomas eucariotas mediante la entrega de componentes CRISPR/Cas. Aquí presentamos JoinTRV, un sistema de vectores mejorado basado en el virus del cascabel del tabaco (TRV) que simplifica la logística del silenciamiento génico y la edición del genoma. Nuestro sistema consta de dos mini vectores de ADN-T en los que se expresan el ARN1 del TRV (pLXTRV1) y una versión modificada del ARN2 del TRV (pLX-TRV2). Los dos vectores tienen orígenes compatibles que permiten su cotransformación y mantenimiento en una sola célulaAgrobacterium, así como su entrega simultánea a las plantas mediante un enfoque de unaAgrobacteria/dos vectores. Los vectores JoinTRV son sustancialmente más pequeños que los de cualquier sistema de vectores TRV conocido, y pLX-TRV2 puede personalizarse fácilmente para expresar las secuencias deseadas mediante digestión-ligación en un solo paso y clonación basada en la homología. El sistema se utilizó con éxito enNicotiana benthamiana para lanzar la infección por TRV, para la producción de proteínas recombinantes, así como para el silenciamiento génico robusto inducido por el virus (VIGS) de transcripciones endógenas utilizando suspensiones bacterianas a bajas densidades ópticas. La entrega mediada por JoinTRV de ARNs de guía única en un huésped transgénico Cas9 permitió eficiencias de edición de células somáticas de ≈90%; los eventos de edición fueron heredables y >50% de las plántulas de la progenie mostraron mutaciones en los loci objetivo.